Cannabinoidsynthese und Gentechnik (Cannabis Genom)

Bild 1: Erdbeer Trichome am Begin der Blüte
Bild 2: Milchige Trichome zeigen den Höhepunkt der THC-Synthese

Vor dieser Untersuchung war die Synthese von [lexicon]THC[/lexicon] und [lexicon]CBD[/lexicon] auf
genetischer Ebene kaum erforscht. Man konnte bis dahin nur wenige, an
der THC-Synthese beteiligte Enzyme identifizieren aber das Zusammenspiel
von Genen und den Cannabinoiden selber nicht komplett erklären. Erst in
dieser neuen Studie war es möglich 19.Gene zu charakterisieren, die
direkte Auswirkungen auf die THC/CBD-Synthese haben. Vor allem ein Gen,
mit dem Namen „AAE3“ scheint einen grossen Einfluss auf die Bildung
einer THC-Vorstufe zu haben, da es nur in Purple Kush erfolgreich
nachgewiesen wurde. AAE3 hat eine ähnliche Sequenz wie ein Gen, das bei
der „Ackerschmalwand“ gefunden wurde und das für die Bildung und
Aktivierung mittlerer und langkettiger Fettsäuren wie der „Carbonsäure“
verantwortlich ist. Cannabinoide sind im Grunde nichts anderes als
Polyketide. Das sind natürliche Stoffe die pharmakologische
Eigenschaften besitzen und die von sogenannten Polyketid-Synthasen
(Enzymen) gebildet werden. Bei der [lexicon]THC[/lexicon] und CBD-Synthese beginnt alles
mit der Bildung von Fettsäuren und den beiden Biomolekülen
„Geranyldiphosphat“ (GPP) und „Olivetolsäure“. Aus diesen beiden
Präkursoren oder Vorläufern, entsteht das [lexicon]Cannabinoid[/lexicon]
„Cannabigerolsäure“ oder abgekürzt auch „CBGA“. Anschliessend wird CBGA
durch Enzyme in „Tetrahydrocannabinolsäure“ umgelagert und durch
UV-Licht oder Hitze in das psychoaktive Delta-9-Tetrahydrocannabinol
umgewandelt.

Diesen gesamten Prozess unterteilt man nun in vier Stufen. Die
erste Stufe ist die Bildung und Aktivierung der Carbonsäure durch
spezielle Enzyme und Lyasen. Die zweite Stufe nennt man auch
„MEP-pathway“. Durch sie wird eine „prenyl-Seitenkette“ bereit gestellt,
die in der dritten Stufe, der „Geranyldiphosphat“ Bildung benötigt
wird. Zusätzlich wird eine „Aromatische Prenyltransferase“ (PT)
hinzugefügt. Diese ermöglicht eine Übertragung eines
„Oligoprenyldiphosphaten“ auf einen Aromaten unter Bildung einer
irreversiblen „CC-Bindung“. Erst das Prenyltransferase-Enzym ermöglicht
eine Biokatalyse von GPP und Olivetolsäure zu Cannabigerolsäure. In der
vierten und letzten Stufe wird CBGA durch Oxidation zu
„Hydroxycannabigerol“ und durch eine weitere Katalyse in
Cannabidiolsäure (CBDA) oder in Tetrahydrocannabinolsäure (THCA)
umgewandelt. Dabei wird jede dieser Stufen durch vier bis neun [lexicon]Gene[/lexicon]
reguliert. Darüber hinaus stellte man fest, das bei Nutzhanf und
Ruderalis Arten [lexicon]Gene[/lexicon] fehlen, welche eine Katalyse von CBGA in THCA
steuern. Bei THC-reichen Sorten werden dagegen die [lexicon]Gene[/lexicon] für eine CBGA in
[lexicon]CBD[/lexicon] Umwandlung nur sehr schwach exprimiert. Das erklärt warum
THC-reiche Sorten je nach Herkunft eine höhere oder eine niedrigere
CBD-Menge produzieren können, [lexicon]THC[/lexicon] aber in allen Nutzhanfsorten so gut
wie nicht vertreten ist. Die Polygene Eigenschaft der [lexicon]Cannabinoid[/lexicon]
Synthese ist bei Purple Kush und allen anderen THC-haltigen Genetiken um
ein vielfaches stärker ausgeprägt, als bei Finola oder USO-31. Das
heisst, das alle verantwortlichen [lexicon]Gene[/lexicon] früher und deutlich stärker
exprimiert werden als dies bei Nutzhanf Sorten der Fall ist. Auch die
Anzahl und die Kopien Protein codierender [lexicon]Gene[/lexicon] scheint bei THC-reichen
Sorten viel höher zu sein. Um die Expression noch genauer zu
untersuchen, entnahm man in verschiedenen Lebensphasen Gewebeproben und
verglich die Genexpression, der für die [lexicon]THC[/lexicon] und CBD-Synthese
verantwortlichen [lexicon]Gene[/lexicon]. Man stellte fest, das in Stamm.- und Wurzelzellen
während der gesamten Blütephase [lexicon]Gene[/lexicon] exprimiert werden, die Stufe 2 und
Stufe 3 der THC/CBD-Synthese regulieren.

[lexicon]Gene[/lexicon] welche für die vierte Stufe verantwortlich sind, wurden in den
Blüten selber, vor allem in der mittleren und späten Blütephase
exprimiert. Einige [lexicon]Cannabinoid[/lexicon] Vorstufen konnte man auch schon in der
Wachstumsphase in allen Gewebeproben nachweisen, auch wenn die stärkste
Expression in den Wurzeln deutlich niedriger ist, als die schwächste
Gen-Expression in allen den anderen Gewebearten. Durch eine
„SAGE-Analyse“ fand man zum Beispiel heraus, das „Purple Kush“ ein
Transkriptom von etwas über 32.000 Genen besitzt. Das heisst, das zu
einem bestimmten Zeitpunkt annähernd 25.000 - 30.000 [lexicon]Gene[/lexicon] aktiv sind
deren Transkripte in mRNA umgeschrieben werden. Die etwas veraltete
Vorstellung das ein Gen auch ein Protein ist, konnte schon vor Jahren
widerlegt werden. Meist wird ein Transkript zu mehreren aber ähnlichen
mRNAs umgeschrieben. So ist es möglich, das mehrere verschiedene
Prozesse mit einem einzigen Gen-Transkript ablaufen.

Um die Vererbungsmuster der für die [lexicon]Cannabinoid[/lexicon] Synthese
verantwortlichen [lexicon]Gene[/lexicon] zu untersuchen, kreuzte ein Biologe in den frühen
90er Jahren eine THC-haltige Genetik mit einer Nutzhanfsorte.
Die Pflanzen der F1-Generation besassen einen mittleren [lexicon]THC[/lexicon] und einen mittleren
CBD-Gehalt. Wie wir aus früheren Kapitel wissen, treten solche
Mischungen immer bei einem „intermediären Erbgang auf. Das würde
heissen, das die Eigenschaft der [lexicon]Cannabinoid[/lexicon] Synthese bei beiden
Elternteilen dominant vererbt wird. Um diese These zu stützen kreuzte
man anschliessend zwei F1-Pflanzen und erhielt in der F2-Generation
unterschiedliche Pflanzentypen im Verhältnis 1:2:1. Eine Pflanze hatte
einen hohen CBD-Gehalt aber kein [lexicon]THC[/lexicon], während eine andere weibliche
Pflanze einen hohen THC-Gehalt aber nur wenig [lexicon]CBD[/lexicon] enthielt. Die letzten
beiden Females waren wieder eine Mischung aus einem mittleren
CBD/THC-Gehalt. Dieses Ergebnis deutet darauf hin, das es zwei
verschiedene aber miteinander verbundene Bereiche geben muss, auf denen
sich jeweils die [lexicon]Gene[/lexicon] für die THC-Synthese und die [lexicon]Gene[/lexicon] für die
CBD-Bildung befinden.

Neuste Analysetechniken bestätigten dieses Resultat abermals und
widerlegten gleichzeitig die frühere Meinung, bei der man davon aus
ging, das sich die [lexicon]Gene[/lexicon] für die THC/CBD-Synthese auf einem gemeinsamen
Genlocus befinden. Doch in wie können Grower, Züchter und Biologen von
diesen neuen Ergebnissen profitieren und die Erkenntnisse auch
umsetzten? Eine grosse Bedeutung kommt hier einem Thema zu, das die
meisten Grower eher abschreckt als wirklich interessiert. Es geht um die
Gentechnik und um das gezielte Verändern eines Genoms.

Bild 1: OG Kush
Bild 2: Viel [lexicon]THC[/lexicon] Gehalt Wenig [lexicon]CBD[/lexicon] Die OG Kush


Genetisch veränderte Pflanzen gibt es heute in allen Grössen und
Formen, sogar im Handel erhältliche Obst und Gemüsearten können auf
genetischer Ebene manipuliert sein. Doch auch vor Tieren macht diese
Entwicklung nicht halt. Schon vor vielen Jahren wurde bei Schafen und
Kühen spezielle Protein bildende [lexicon]Gene[/lexicon] eingesetzt, die bei der
Medikamenten Herstellung benötigt werden und synthetisch nicht
herstellbar sind. BSE resistente Kühe, Hühner die Immun gegen die
Geflügelpest sind oder Stechmücken, die keinerlei Krankheiten auf den
Menschen übertragen können. Es gibt fast nichts, was mit der Gentechnik
nicht möglich wäre.

Kennt man die [lexicon]Gene[/lexicon] der [lexicon]Cannabinoid[/lexicon] Synthese, dann wäre es durchaus
möglich diese auch auf andere Pflanzenarten oder auf [lexicon]Bakterien[/lexicon] zu
übertragen. Das Ergebnis wären vielleicht [lexicon]THC[/lexicon] produzierende Hopfen
Pflanzen oder [lexicon]CBD[/lexicon] bildende Bakterienkolonien. Man könnte auch [lexicon]Cannabis[/lexicon]
Pflanzen entwickeln, die ein abgestimmtes Verhältnis an Cannabinoiden
besitzen und so eine optimale Wirkung bei der Schmerzlinderung erzielen
könnten.

Man könnte auch ein Resistenz-Gen einbringen, welches Pflanzen
gegen bestimmte [lexicon]Schädlinge[/lexicon] oder gegen Schimmelbefall Immun machen
könnte, was wiederum einen Anbau auch ausserhalb der optimalen
Anbaugebiete zulassen würde. Die Möglichkeiten, vor allem in der
medizinischen Anwendung sind einfach gewaltig und wir reden hier nur von
Hanf und den Cannabinoiden. Die Gentechnik könnte einen enormen Beitrag
zur Bekämpfung des Welthungers leisten und Probleme lösen, die schon
Hunderttausende Menschenleben gekostet haben. Aber wie kann man [lexicon]Gene[/lexicon]
einfach so in andere Organismen einbringen? „GVO`s“ oder „genetisch
veränderte Organismen“ sind Individuen, die gezielt und direkt verändert
wurden und sich damit komplett von Züchtungen oder natürlichen
Mutationen unterscheiden.

Zur Gentechnik zählt nicht nur das Abschalten von Genom eigenen
Genen, sondern auch das Einbringen von Artfremder oder Arteigener DNA.
Würde man ein Gen von einer anderen Pflanzenart in eine Hanfpflanze
einschleusen, so würde man diese [lexicon]Cannabis[/lexicon] Pflanze als einen „Transgenen
Organismus“ bezeichnen, die übertragenen [lexicon]Gene[/lexicon] als „Transgene“. Der
Ablauf zur Herstellung Transgener Organismen ist im Grunde immer der
Gleiche. Es hängt natürlich auch von der Technik ab und davon, ob
[lexicon]Bakterien[/lexicon], Pflanzen oder gar ein Tier als Transgener Organismus
ausgewählt wurde. Wir wollen an dieser Stelle einmal die Herstellung
einer [lexicon]Cannabis[/lexicon] Pflanze durchspielen, in die ein Gen für die
Schimmelresistenz eingefügt werden soll. Dafür brauchen wir zuerst
einmal die Zellen einer Hanfpflanze. Hier verwendet man meist sogenannte
„Protoplasten“, die man aus verschiedenen Teilen der Pflanze gewinnen
kann. Protoplasten sind einzelne, lebensfähige Zellen, die man auf
Nährböden [lexicon]kultivieren[/lexicon] kann und die sehr leicht Fremd-DNA aufnehmen. Da
Pflanzenzellen im Gegensatz zu Tieren Zellwände besitzen, muss man diese
vorher durch Enzyme auflösen. Als zweites wichtiges Grundelement wird
natürlich auch das entsprechende Gen benötigt, das in die [lexicon]Cannabis[/lexicon]
Pflanze eingebaut werden soll. Solche [lexicon]Gene[/lexicon] stammen fast immer von
genetisch ähnlichen oder Art verwandten Individuen. Es ist aber
grundsätzlich auch möglich, [lexicon]Gene[/lexicon] von Artfremden Organismen zu verwenden,
da sich die Gensequenzen in den meisten Fällen nur durch einzelne
Basenpaare unterscheidet.

Bild 1: Hand DNA-Extraktion mit Hausmitteln
Bild 2: Wurzelzellen unter 800facher Vergösserung
Bild 3: Wirklich Schöne Köpfe

Als erstes schneidet man mit bestimmten Restriktionsenzymen die
Plasmid-DNA an zwei Punkten. Danach kann man unsere Gen-Sequenzen durch
Ligase Enzyme wieder zu einem „Plasmid“ oder einem „Vektor“
zusammenfügen.

In diesem Fall verbinden wir die Plasmid-DNA mit der Sequenz des
einzufügenden Gens. Das routinemässig bei Pflanzen eingesetzte
„Ti-Plasmid“ wird nun in eine Bakterienkolonie, meist in „Escheria coli“
übertragen und vermehrt, genauso wie es auch bei der Vervielfältigung
einer DNA-Sequenz zur DNA-Analyse gemacht wird. Jetzt isoliert man die
Plasmid-DNA, in der sich auch unser Gen der Schimmelresistenz befindet.

Man fügt nun grosse Mengen dieser „T-DNA“ einem Bakterium namens
„Agrobacterium tumefaciens“ zu und infiziert damit, die in der
Nährlösung kultivierten Pflanzenzellen, also die vorher entnommenen
Protoplasten. Durch eine Hormonbehandlung werden die infizierten Zellen
zur Zellteilung angeregt bis kleine Sprösslinge entstehen, die das
eingebrachte Gen der Schimmelresistenz in sich tragen. Diese neu
entstandenen Pflanzen besitzen nun unser eingebrachtes
Schimmelresistenz-Gen. Das Ergebnis sind Transgene Pflanzen, die ein
völlig neues Merkmal in sich tragen. Würde man mit diesen Pflanzen aber
neue [lexicon]Samen[/lexicon] erzeugen, dann würde sich das eingefügte Merkmal nicht mehr
im Genom der Folgegeneration befinden. Man muss hier bedenken in welche
Zellen wir das neue Gen eingefügt haben. Bringt man ein Transgen in eine
Körperzelle, zum Beispiel in eine Blattzelle ein, so erhalten nur die
Nachkommen dieser einen [lexicon]Zelle[/lexicon] das Transgen, nicht aber die Nachkommen
anderer Gewebezellen und schon gar nicht die Zellen der Folgegeneration.
Möchte man das auch die Nachkommen das neue Merkmal in sich tragen, so
muss das Transgen in das Genom der Keimbahn gelangen. Nur auf diese
Weise kann man ein Transgen an eine neue Pflanzengeneration weitergeben.
Im Falle der [lexicon]Cannabis[/lexicon] Pflanze müsste man das Transgen in die männliche
„Pollenmutterzelle“ und in die weibliche „Embryomutterzelle“ übertragen,
da man bei Pflanzen nicht von Eizellen und Spermien spricht.

Bild 1: Ablauf zum Einbringen einer neuen Eigenschaft
Bild 2: Arbeitsweise der Restriktionsenzyme
Bild 3: Einschlösen der Fremd DNA
Bild 4: Microinjection in Pflanzenzelle

Es gibt nun verschiedene Techniken wie man Fremd-DNA in nicht
verwandte Organismen einbringt. In unserem Beispiel wurde das Transgen
in sogenannte „Protoplasten“ eingefügt. Man kann anstelle dieser
Protoplasten auch kleine „Blattstücken“ oder andere Gewebezellen
verwenden. Allerdings muss man hier die Zellmembran kurzzeitig dazu
bringen, die Fremd-DNA durchzulassen. Hier kommt unter anderem die
„Elektroporation“ zum Einsatz. Dabei wird ein elektrisches Feld durch
einen sich schnell entladenen Kondensator erzeugt, was die Zellmembran
für kurze Zeit durchlässig macht. Die zugefügte Fremd-DNA kann nun
direkt in eine lebende [lexicon]Zelle[/lexicon] eingebracht werden. Eine andere Methode
wird auch als „Mikroinjektion“ bezeichnet. Diese Technik wird sehr oft
bei Tieren oder [lexicon]Bakterien[/lexicon] eingesetzt, da Pflanzenzellen eine
vergleichsweise feste Zellwand besitzt, was das Einbringen von DNA mit
einer Glaskapillare nicht gerade einfach macht. Die dritte Möglichkeit
zum Einschleusen von Transgenen in ein neuen Organismus ist der
„Partikelbeschuss“. Dabei werden mit DNA bestückte Wolfram Kügelchen in
die Zellen geschossen. Aber man kann sich schon denken das diese Methode
sehr ungenau ist, da man wirklich alles treffen kann was sich in einer
[lexicon]Zelle[/lexicon] befindet.

Es gibt noch einige andere Techniken, wie zum Beispiel Ultraschall
oder Phagenzellen, die es erlauben bestimmte Gen-Sequenzen in Fremde
Organismen einzubringen.

Ob es nun wirklich für Grower und Züchter interessant wäre
genetisch veränderte [lexicon]Cannabis[/lexicon] Pflanzen oder manipuliertes Saatgut zu
kaufen oder anzubieten glaube ich nicht. Doch früher oder später wird
die Gentechnik auch in diesem Bereich der Pflanzenzucht Einzug halten.
Ob die Grower diese Entwicklung dann auch mit machen sei aber einmal
dahin gestellt.

Weitere Infos und Tutorials auf https://www.alpine-seeds.net